穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建是利用哺乳動(dòng)物系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白，主要方式有瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選兩種。通過穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。針對瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，外源基因在短時(shí)間轉(zhuǎn)錄翻譯得到的蛋白量較少，1mg質(zhì)粒得到1mg蛋白，能夠滿足小量蛋白制備，大量生產(chǎn)成本很高。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的是將外源基因整合到細(xì)胞自身的基因組上，隨著細(xì)胞的生長分裂外源基因可以穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)經(jīng)過抗生素加壓篩選，最終得到能夠穩(wěn)定表達(dá)蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞系。
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑為例的操作流程，不同轉(zhuǎn)染試劑請參考說明書：
1.將復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞按照1-3x10^5接種到6孔板中，加入2-4ml的*培養(yǎng)基，混勻放置在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃過夜；
2.無菌狀態(tài)下配置如下溶液
①用100ul的無血清培養(yǎng)基稀釋2ug的待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒；
?、谟?00ul的無血清培養(yǎng)基稀釋25ul的Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑（血清的存在會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，因此要使用無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染）。
3.將ab溶液混合并搖勻，室溫下放置30min左右；
4.細(xì)胞培養(yǎng)至80%單層左右，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，每孔加入1ml的無血清培養(yǎng)基，并將混合后的ab溶液逐滴加入到每孔，按十字方向輕搖混勻，二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)；
5.將轉(zhuǎn)染液倒出，換為*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
更新時(shí)間：2021-07-02 
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