重組蛋白表達(dá)要統(tǒng)一考慮和整體設(shè)計(jì)

　　重組蛋白表達(dá)的常見(jiàn)問(wèn)題是真核蛋白在細(xì)菌中表達(dá)時(shí)傾向于不溶。變性，聚集和/或截短形式的蛋白形成不可溶的包涵體，需要進(jìn)一步純化和重折疊，這可能是低效的和不*的。

　　分離純化組成了基因工程的下游處理（downstream processing)階段，這一過(guò)程又和上游過(guò)程緊密相聯(lián)系，上游過(guò)程的諸方面影響到下游的分離純化,所以在進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)純化時(shí)要統(tǒng)一考慮和整體設(shè)計(jì)，并充分考慮上游因素對(duì)下游的影響，如是否帶有親和標(biāo)簽，是否進(jìn)行分泌表達(dá)。目前應(yīng)用*泛的表達(dá)系統(tǒng)有三大類(lèi)，分別是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)和CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),不同的表達(dá)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法顯著影響下游的處理過(guò)程,目標(biāo)蛋白表達(dá)是否形成包涵體，目標(biāo)蛋白表達(dá)的定位（胞內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)膜、周質(zhì)空間和胞外)，蛋白表達(dá)的量都依賴(lài)于所選擇的表達(dá)系統(tǒng)。

　　選擇將所表達(dá)的蛋白分泌到細(xì)胞外或周質(zhì)空間可以避免破碎細(xì)胞的步驟，并且由于蛋白質(zhì)種類(lèi)少，目標(biāo)蛋白容易純化;而在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)蛋白，可能是可溶性表達(dá)，可能形成包涵體，可溶性的蛋白往往需要復(fù)雜的純化步驟，而包涵體易于分離，純度較高，但回收具有生物活性的蛋白卻變的相當(dāng)困難，需要對(duì)聚集的蛋白進(jìn)行變復(fù)性，通常活性蛋白的得率比較低，表1列出了不同策略對(duì)表達(dá)、純化的影響，對(duì)于其中的有些缺點(diǎn)可以通過(guò)一定的方法進(jìn)行克服和避免，如利用DNA重組技術(shù)給外源蛋白加上一個(gè)親和純化的標(biāo)簽，有助于可溶性外源蛋白的選擇性純化，并能保護(hù)日標(biāo)蛋白不被降解（96)。

　　在細(xì)胞的提取物中，除了目標(biāo)蛋白外，還含有其它各種性質(zhì)的蛋白、核酸、多糖等。在這樣一個(gè)混合體系中，蛋白質(zhì)純化要求將目標(biāo)蛋白與其它的成分分離，得到一定的量，達(dá)到一定的純度，同時(shí)要盡可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白質(zhì)的分離純化可以看作是一系列的分部收集過(guò)程，總是希望目標(biāo)蛋白富集于其中的一個(gè)收集部位，而大量的雜蛋白存在于其它的收集部位。當(dāng)然對(duì)目標(biāo)蛋白純度的要求要根據(jù)純化蛋白的用途而定，對(duì)于治療性的蛋白要求有大于99%的純度，并對(duì)處方有活性和穩(wěn)定性的要求，對(duì)于某些酶的純度則要求較低，需要在純度和得率之間進(jìn)行一個(gè)平衡，所以下游的工藝流程取決于最終對(duì)目標(biāo)蛋白的要求。